無(wú)菌制劑容器密封性測試方法匯總

     無(wú)菌 藥品在使用前的無(wú)菌保證，是藥品管理法規的要求。因此，必須有容器完整性（Container Closure Integrity-CCI）的驗證和監測，以確保在無(wú)菌藥品生產(chǎn)，質(zhì)控，運輸和儲存，乃至產(chǎn)品有效期的整個(gè)生命周期過(guò)程中，產(chǎn)品不受微生物的污染，確保病人用藥安全。目前各個(gè)國家的藥政法規，都有提供容器完整性CCI的測試方法，但是沒(méi)有提供具體細節，指導如何合理的選擇方法，及評價(jià)一個(gè)無(wú)菌藥品包裝系統( Container Closure System-CCS)的完整性。方法的合理選擇，以及科學(xué)的制定一個(gè)可接受的標準，和產(chǎn)品的性質(zhì)和包裝系統密不可分。歐洲醫藥同盟多次開(kāi)會(huì )探討容器完整性測試的最佳方法，卻得出結論，并不存在容器完整性測試的一個(gè)黃金標準，在考慮無(wú)菌制劑的既定用途和產(chǎn)品設計的基礎上，需要采取一個(gè)靈活的方法，來(lái)評估產(chǎn)品的包裝容器完整性。

   美國藥典修訂了容器完整性測試（Container Closure Integrity Testing-CCIT）的通則方法USP<1207>。這個(gè)修訂緣于上世紀70年代的一個(gè)醫療事故，當時(shí)美國雅培工廠(chǎng)的一個(gè)靜脈輸注產(chǎn)品的包裝系統做了更換，在醫院注射此產(chǎn)品的病人廣泛爆發(fā)敗血癥，導致10%的病人因此死亡，經(jīng)調查證實(shí)更換的包裝系統存在密封完整性的缺陷，使產(chǎn)品遭受微生物污染。這個(gè)悲劇事件，以及不斷提升的藥政監管要求，強調了制藥企業(yè)確保無(wú)菌制劑包裝完整性的重要性。

方法簡(jiǎn)介和選擇依據

   根據USP通則<1207>，將容器密封完整性測試的檢測方法分成確定性和概率性?xún)煞N類(lèi)型。確定性檢測方法包括：高壓泄漏檢測法，激光頂空分析，氦氣泄漏測試，質(zhì)子流法，壓力衰減法，真空衰減法，和Corona電極放電法。概率性檢測方法包括：氣泡發(fā)射法，色水法，和微生物挑戰法。

   每個(gè)方法有其不同的靈敏度以及選擇參考點(diǎn)。制藥企業(yè)需要把包裝系統CCS作為藥品開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，用質(zhì)量源于設計（Quality by Design-QbD）的理念，在藥品設計到生產(chǎn)的整個(gè)生命周期內，基于不同階段藥品有不同的應用目的，選擇合適的、CCIT方法。在選擇CCIT方法的時(shí)候，必須充分理解內包裝的材料特點(diǎn)，制作工藝參數，和操作中的控制方法。此外，對于容器密封性的可接受標準，在不同的產(chǎn)品發(fā)展階段也會(huì )有所不同。

在選擇一個(gè)合適的容器完整性測試CCIT方法的時(shí)候，需要考慮以下因素：

-     方法的既定用途，即，用于包裝系統的開(kāi)發(fā)和確認，還是商業(yè)生產(chǎn)階段的過(guò)程控制或驗證，還是穩定性測試；

-       包裝系統開(kāi)發(fā)前的認知，即，是開(kāi)發(fā)該產(chǎn)品和包裝系統，還是改進(jìn)一個(gè)新產(chǎn)品的包裝系統；

-       包裝系統的形式，即，小玻璃瓶，注射器，藥品和醫療器械的復合制劑，還是靜脈點(diǎn)滴用袋子；

-       包裝系統的材料，是延展性材料，玻璃，還是高分子聚合物；

-       藥品的類(lèi)別，即，液體制劑，凍干粉制劑，小分子產(chǎn)品，還是大分子產(chǎn)品，水相制劑，溶劑制劑，還是油相制劑，產(chǎn)品導電性如何，產(chǎn)品黏度，頂空氣體的組成，常壓，還是真空包裝，或是過(guò)壓包裝；

-       測試時(shí)間長(cháng)短的考量；

-       要求的方法靈敏度；

-       樣本做人工泄漏的可行性和人工泄漏方式

-       用于專(zhuān)屬研究的樣本量；

-       樣本制備的考量，以及樣本制備帶來(lái)的潛在風(fēng)險，比如需要移除標簽，或需要排空小瓶，或需要清潔小瓶。

在很多情況下，包裝密封性測試方法的最初選擇，是基于某特定測試技術(shù)的經(jīng)驗。隨著(zhù)制藥企業(yè)經(jīng)驗的積累，類(lèi)似產(chǎn)品或包裝的參考，還有文獻的參考，以及行業(yè)標準和指南文件的指導，在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)到發(fā)展的整個(gè)生命周期，會(huì )采用不同的測試方法。在測試方法選擇上，還需要考慮以下因素：

?對測試樣本的破壞性還是非破壞性；

?測試的方法是內聯(lián)，在線(xiàn)，離線(xiàn)，還是近線(xiàn)；

?測試的有效性考量，包括測試速度（比如單位時(shí)間內的測試量），測試的產(chǎn)出（包括樣本平衡的時(shí)間和控制組的測量）

? 測試頻率和計劃：只需要測試一次還是需要多次，比如需要在穩定性方案中測試（氣體滲透的潛在影響）；

?測試成本，包括設備的購買(mǎi)，方法和設備的驗證，測試條件的維護成本；

?用于測試裝載的包裝系統，還是空載的包裝系統

?是否干擾藥品的理化測試；

?方法操作的特點(diǎn)：靈敏度，方法的耐用性，精密度，和準確度；

?測試結果的表述方式：通過(guò)/失?。?，判定是否存在超過(guò)方法靈敏度的泄漏），泄漏位置的標記，還是能定量的測出泄漏孔的大小或泄漏流量；

? 泄漏樣品帶來(lái)的設備污染風(fēng)險。

  不管選擇哪個(gè)測試方法，測試儀器都需要經(jīng)過(guò)校驗，測試方法也需要通過(guò)驗證，測試方法的系統適用性試驗，應該包括陽(yáng)性控制（即已知泄漏的樣本）和陰性控制（即沒(méi)有人工泄漏的樣本）。

方法特點(diǎn)和應用范圍

下文將對各種常見(jiàn)測試方法的優(yōu)缺點(diǎn)和應用范圍做詳細探討。

1）高壓泄漏檢測法

   High-voltage leak detection

這是一種確定性的泄漏測試方法。高壓電檢漏是基于定量的電導測試，要求容器內灌裝的液體有一定的電導率，在待檢品上外加高壓電，泄漏點(diǎn)的存在導致樣品電阻的下降，從而導致電流的突躍，當然這個(gè)電流應該大于預先確認的方法檢測閾值（通過(guò)/失敗判定的靈敏度）。

該方法的優(yōu)點(diǎn)：

-       不需要破壞樣本

-       可以做到100%的在線(xiàn)測試

-       高速的測試

-       不需要測試前的樣品制備

-       其準確性獨立于員工的操作技能

-       在常壓下測試

該方法的缺點(diǎn)：

-       只有通過(guò)/失敗兩種結果，沒(méi)有定量的結果

-       藥品本身的電導應該大于包裝材料的電導

-       有可能破壞到產(chǎn)品（比如引起蛋白質(zhì)的降解）

-       制劑液體必須不是易燃液體

-       測試過(guò)程會(huì )產(chǎn)生臭氧

-       對于特定的包裝系統，需要的固定裝置

-       電極必須離泄漏點(diǎn)在一定的距離內

-       藥品液體需要和泄漏點(diǎn)接觸或者非?？拷?/p>

-       產(chǎn)品堵塞泄漏孔會(huì )導致測試結果不準確

-       不適用于凍干粉制劑產(chǎn)品

該方法的應用范圍和建議：

-       對于商業(yè)化生產(chǎn)線(xiàn)的高產(chǎn)出的檢測。

-       需要評估產(chǎn)品接觸到高壓后的質(zhì)量影響。

-       在長(cháng)期穩定性樣品的泄漏測試上受限，這主要是由于長(cháng)期儲存過(guò)程中液體風(fēng)干堵塞泄漏孔。

-     產(chǎn)品的電導可能不足以檢測出泄漏

-     可以把100%的在線(xiàn)檢測模式整合到自動(dòng)目測檢查的生產(chǎn)線(xiàn)中。

-       在100%的在線(xiàn)測試中依舊受到限制，這主要是由于方法有其靈敏度，只能測試到大于靈敏度的泄漏。

-       當泄漏點(diǎn)在小瓶的頂端位置，比如在閘蓋處，沒(méi)有和液體產(chǎn)品接觸到，該方法就不適用。

2）激光頂空分析

   Laser-based headspace analysis

這是一種確定性的泄漏測試方法。激光法是通過(guò)監測容器頂空壓力、水汽和頂空氧變化來(lái)判定容器的完整性，原理是發(fā)射的激光穿透容器頂空，容器頂空的水汽和氧對激光有吸收，激光吸收量和對應的物質(zhì)含量成正比。頂空水汽的吸收峰寬度和頂空壓力成正比，因此可以通過(guò)頂空水汽的吸收峰寬來(lái)獲得頂空壓力。

該方法的優(yōu)點(diǎn)：

-       不需要破壞樣本

-       可以做到定量測試

-       可以做到100%的在線(xiàn)測試

-       高速率的測試

該方法的缺點(diǎn)：

-       包裝容器必須是透明的

-       需要在包裝瓶的頂空有可以改變的氣體環(huán)境

-       需要頂空部位有一定的空氣體積供于檢測

-       在探測小尺寸的泄漏上，會(huì )延長(cháng)測試的時(shí)間

-    變更設備的部件時(shí)需要包含所有不同的尺寸和型號

該方法的應用范圍和建議：

-       對于微米級孔徑大小的泄漏，測試可能需要耗時(shí)幾周的氣體交換。

-       測試方法方便使用

-       可用于評估瞬間發(fā)生的泄漏（比如測試需要低溫儲存的產(chǎn)品）

-       有可能導致錯誤的測試結果，尤其是在穩定性研究中，由于氣體的滲透或被液相吸收。

-       由于快速的和環(huán)境壓力平衡，大尺寸的泄漏可能無(wú)法測出（比如測試低溫儲存的產(chǎn)品）。

-       不容易區別出不同尺寸的泄漏。

-       不容易甚至不能夠測試出在液面下的泄漏，因此，只適用于預灌注注射器。

-       凍干粉制劑產(chǎn)品可能會(huì )導致泄漏的堵塞。

-       有部分的壓力依賴(lài)于溫度。

3）真空衰減法

   Vacuum decay

這是一種確定性的泄漏測試方法。真空衰減法是將包裝容器置于專(zhuān)門(mén)的測試腔體內，對測試腔體抽真空，容器內外壓差使得容器內部氣體通過(guò)漏孔泄漏進(jìn)入測試腔體，主機壓力傳感器監測到壓力的變化，將壓力變化值和參考值做比較，壓力增大說(shuō)明存在泄漏，以判定容器密封完整性是否格。此方法的測試步驟包括：抽真空、保壓和測試。

該方法的優(yōu)點(diǎn)：

-       不需要破壞樣本

-       可以做到100%的在線(xiàn)測試

-       高速率的測試和產(chǎn)出

-       測試不會(huì )影響生產(chǎn)進(jìn)度

-       有ASTM方法可供參考（ASTM-American Society for Testing and Materials）

-       可適用于液體和凍干粉的制劑

-       可應用于有色包裝瓶和貼好標簽的包裝瓶檢漏

該方法的缺點(diǎn)：

-       儀器昂貴，每種包裝系統需要特定的儀器腔體

-       產(chǎn)品堵塞泄漏孔的情況下會(huì )檢測不出泄漏

-       真空腔體的準備至關(guān)重要（濕度會(huì )影響測試結果）

該方法的應用范圍和建議：

-       此方法適用性很廣，可用于支持產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，商業(yè)化，以及穩定性研究各階段，包裝容器的密封性檢查。

-       適用于液體和凍干粉的制劑。

-       可應用于包裝器械的測試，和貼好標簽的包裝瓶檢漏。不過(guò)，相對于未貼標簽的初級包裝，其檢測靈敏度是降低的。

-       只限于在線(xiàn)測試，并會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性結果（比如，當有滯留氣體在閘蓋處時(shí)；或者受到濕度波動(dòng)的影響時(shí)）。

-       方法開(kāi)發(fā)研究表明，該方法對凍干粉，預灌注液體的注射器，和小容量瓶液體制劑具有等同的靈敏度。

-       當應用于液體制劑時(shí)（黏度限制），鐳射穿孔的陽(yáng)性控制樣本容易出現堵塞的情況；對預灌注注射器，細孔也很容易被蛋白質(zhì)或硅油堵塞。

-       壓力變化和泄漏的尺寸，泄漏的速率有量級的相關(guān)性。然而，無(wú)法區分泄漏是來(lái)自于多個(gè)泄漏小孔還是單個(gè)，或者是包裝連接處的裂縫。

4）微生物挑戰法(浸入或氣溶膠挑戰)

   Microbial immersion or aerosol challenge

這是一種概率性的泄漏測試方法，此檢查通常與模擬灌裝同時(shí)進(jìn)行。通過(guò)按照模擬灌裝驗證方案進(jìn)行培養基模擬灌裝，然后進(jìn)行壓塞軋蓋后，目檢合格，經(jīng)已驗證的滅菌柜滅菌后，將容器密封面浸入到高濃度的菌液中，使樣品容器內的培養基充分接觸封口內表面，樣品的頸部及封口的外表面應*浸泡在菌懸液中，浸泡一定時(shí)間后取出，定期培養后檢查是否有微生物侵入，以確定容器密封系統的完整性。同時(shí)，需要做陽(yáng)性對照試驗，確認培養基的促生長(cháng)能力。測試中通常會(huì )運用真空或過(guò)壓的挑戰條件。

該方法的優(yōu)點(diǎn)：

-       數十年來(lái)獲得廣泛應用。

-       是整個(gè)行業(yè)和法規熟識的做法。

-       可以與模擬灌裝結合，同步進(jìn)行。

-       對產(chǎn)品特性的直接評價(jià)（即，確保容器密封性可以使產(chǎn)品免受微生物污染）。

該方法的缺點(diǎn)：

-       對樣品的破壞性。

-       只有通過(guò)或失敗的結果，沒(méi)有定量測試。

-       不可能進(jìn)行100%的樣本測試。

-       測試會(huì )耗時(shí)數周。

-       需要比較多的勞動(dòng)力。

-       只能適用于可以做培養基罐裝的包裝系統。

-       可能會(huì )導致假陽(yáng)性或假陰性的結果；測試的靈敏度部分依賴(lài)于分析員的操作技巧。

-    對于微小瑕疵，測試具有隨機性。

-    不同國家地區，對于培養基，所用菌種和測試方法還沒(méi)有統一。

該方法的應用范圍和建議：

-       此方法的檢測限隨著(zhù)以下因素波動(dòng)：泄漏的大小，包裝材料，菌種，培養基和挑戰條件。

-       一直被用來(lái)建立關(guān)鍵的泄漏點(diǎn)（根據其泄漏的速率或大?。?。

-       浸入法比氣溶膠挑戰法更普遍，方法條件更容易達到，有更好的重復性。

-       不使用真空或過(guò)壓的條件，自然放置幾周時(shí)間再檢查，更具有代表性，不過(guò)耗時(shí)。

-       如果使用真空或過(guò)壓的條件，可以加速測試，數小時(shí)內就可以做檢查，這種方式可以代表運輸條件，減少測試時(shí)間。

5）染色浴法

   Dye ingress

這是一種概率性的泄漏測試方法。將密封容器*浸沒(méi)在染色浴中，也可在染色浴中加入表面活性劑，對整個(gè)測試腔體進(jìn)行抽真空。如果該容器有裂縫，空氣就會(huì )從瓶中溢出。然后解除真空，這時(shí)泄漏容器內存在負壓，染色溶液會(huì )從裂縫中進(jìn)入瓶?jì)炔?，再對測試腔體加正壓，提高染色液的滲入性，通過(guò)分析員或儀器目檢剔除變色的容器。

該方法的優(yōu)點(diǎn)：

-       數十年來(lái)獲得廣泛應用。

-       有ASTM和ISO的標準方法。

-       是整個(gè)行業(yè)和法規熟識的做法。

-       基礎并且有效率。

-       可靈活應用，同時(shí)測試不同包裝容器的泄漏情況。

-       可以看出泄漏的位置。

-       泄漏位置可以在液相中。

該方法的缺點(diǎn)：

-       對樣品的破壞性。

-       只有通過(guò)或失敗的結果，沒(méi)有定量測試。

-       不可能進(jìn)行100%的樣本測試。

-       必須是透明的包裝系統，用于目測判斷。

-       如果樣品體積本身比較大，只進(jìn)入很少的染色水，有時(shí)不容易分辨出來(lái)。

-       對于微小瑕疵，測試具有隨機性。

該方法的應用范圍和建議：

-       方法具有多用途，可以測試初級包裝和外包裝，用來(lái)支持產(chǎn)品開(kāi)發(fā)階段，商業(yè)化生產(chǎn)，和穩定性研究階段的檢漏測試。

-       直接檢測相關(guān)泄露

-       可以運用不同的染色劑。

-       如果運用優(yōu)化的真空/加壓循環(huán)工藝，可以提高測試的靈敏度。方法的檢測限隨著(zhù)以下因素波動(dòng)：泄漏的大小，包裝材料，染色液的濃度，和挑戰條件。

-       染色液必須是易混合的而且不和產(chǎn)品發(fā)生化學(xué)反應。

-       可以把同樣的挑戰條件應用到微生物侵入試驗法中。

-       對于液體制劑應用良好，但基于染色液的限制，可能對凍干制劑不適合 。

人工穿孔的技術(shù)討論

上述討論的檢漏方法，都需要做方法驗證，需要有明確泄漏的樣本來(lái)做陽(yáng)性控制，以挑戰方法的檢漏能力。對于樣品的人工穿孔，有以下幾個(gè)常用的方法：

-       鐳射穿孔，直接穿透包裝容器本身

-       鐳射穿孔，穿透在和包裝容器相連的金屬片或管 （laser drilling into a metal plate or tubing that is integrated to a CCS ）

-       微米級的金屬絲插入到容器中

-       微量吸管插入到膠塞或連接到容器的一個(gè)人工小孔上

-       毛細管（熔融硅，鎳或玻璃）插入到膠塞或連接到容器的一個(gè)人工小孔上。

每一種方法都有其挑戰性，包括穿孔尺寸的限制，穿孔形狀不規則，穿孔大小難以測量，微小穿孔容易被立即堵上，造價(jià)高等等。目前行業(yè)內沒(méi)有標準來(lái)規定穿孔技術(shù)和孔徑測試的方法。在建立容器密封性測試方法的時(shí)候，每個(gè)公司需要對自己建立的方法做合理性的說(shuō)明，采用適當的方法。

結論

隨著(zhù)修訂版USP<1207>的執行，對于包裝容器密封性測試（CCIT）會(huì )有更多深入的調查，生產(chǎn)無(wú)菌制劑的企業(yè)需要符合不斷發(fā)展的法規期望。對于CCIT的測試方法和可接受標準，目前行業(yè)給予企業(yè)一定的靈活性。正如上述討論，每個(gè)方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)和適用性，市面上的測試儀器也有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，因此，制藥企業(yè)有責任根據產(chǎn)品自身的特點(diǎn)和產(chǎn)品的不同發(fā)展階段，采用風(fēng)險評估的方法，選取并驗證合適的檢漏測試方法，并建立泄漏的可接受標準。

表1. 五種泄露檢測法綜合評價(jià)

表2. 五種泄露檢測法詳細描述